: Главная arrow Клетка и ее структура arrow Муравьинокислое брожение и семейство Enterobacteriaceae  

Муравьинокислое брожение и семейство Enterobacteriaceae

Печать E-mail
 

 

Некоторые микроорганизмы, образующие при брожении кислоты, объе­диняют в одну физиологическую группу на том основании, что харак­терным, хотя и не главным продуктом брожения является у них муравь­иная кислота. Наряду с муравьиной кислотой такие бактерии выделяют и некоторые другие кислоты; такой тип метаболизма называют поэто­му муравъинокислъш брожением или брожением смешанного типа. Так как некоторые типичные представители этой группы обитают в кишеч­нике, все семейство носит название Enterobacteriaceae. Это грам-отрица-тельные, активно подвижные, не образующие спор палочки с перитри-хальным жгутикованием. Будучи факультативными аэробами, они обладают гемопротеинами (цитохромами и каталазой) и способны по­лучать энергию как в процессе дыхания (в аэробных условиях), так и в процессе брожения (в анаэробных условиях). В отношении питания эти бактерии исключительно нетребовательны - растут на простых синтети­ческих средах, содержащих минеральные соли, углеводы и аммоний. Сбраживание глюкозы у всех представителей этой группы происходит с образованием кислот. Значение Enterobacteriaceae для эпидемиологии, а также для разного рода экспериментальных исследований общеизвест­но; поэтому полезно будет рассмотреть здесь некоторых представите­лей этого семейства.

Наиболее важные виды. Escherichia coli- обитатель кишечника, в ко­личественном отношении, однако, не главный (в кишечной флоре пре­обладают Bacteroides и Bifidobacterium). Эта бактерия может некоторое время сохранять жизнеспособность и вне кишечника, и ее легко выя-

 

Image

вить. Этим пользуются для того, чтобы обнаружить загрязнение питье­вой воды фекалиями.

Proteus vulgaris тоже принадлежит к нормальной кишечной флоре, но, кроме того, широко распространен в почве и воде. Эта бактерия из­вестна своей склонностью к изменению формы (отсюда ее название) и большой подвижностью, а также способностью образовывать на по­верхности агара сплошную пленку (разд. 2.2.5).

Enterobacter aerogenes можно в известном смысле считать «близне­цом» Е. соН (оба вида относят к «группе кишечной палочки»). Эта бак­терия широко распространена в почве; как показывает ее видовое на­звание, она образует много газообразных продуктов. От Е. coli она отличается лишь немногими биохимическими признаками (см. табл. 8.4 и 8.5).

Serratia marcescens (прежнее название - Bacterium prodigiosum, или чу­десная палочка) может рассматриваться как вариант Enterobacter, отли­чающийся образованием пигмента.

К роду Erwinia относятся некоторые фитопатогенные виды, пора­жающие стебли, листья и корни. В результате выделения пектиназ они вызывают мягкие гнили.

Klebsiella pneumoniae отличается от Enterobacter только более тол­стой слизистой капсулой и неподвижностью. Ее находят при некоторых тяжелых формах пневмонии.

Salmonella typhimurium-самая распространенная из бактерий, вызы­вающих гастроэнтерит, или так называемую «пищевую токсикоинфек-цию»; в основе симптомов лежит раздражение слизистой желудочно-ки­шечного тракта выделяемыми липополисахариднымй токсинами бакте­рии.  В  кровяное  русло  возбудитель  не  проникает.  Styphi является возбудителем эпидемического брюшного тифа, a Shigella dysenteriae и родственные штаммы-возбудителями дизентерии.

Vibrio cholerae- возбудитель холеры, эпидемической болезни. Он не относится к группе Enterobacteriaceae, но близок к ней по типу метабо­лизма. Холерный вибрион размножается в кишечнике. Он прикрепляет­ся к кишечному эпителию, но не проникает в клетки. Холерный энтеро-токсин - белок, связываемый клетками кишечного эпителия (специфиче­скими рецепторами). Он вызывает переход воды и ионов натрия, бикарбоната и хлорида в просвет кишечника.

Yersinia pestis-возбудитель чумы. Род Yersinia не относится к таксо­номической группе Enterobacteriaceae, но близок к ней по своему фа­культативно-анаэробному образу жизни и по типу брожения. При­родным резервуаром этого возбудителя эпидемий служат дикие грызуны, главным образом крысы. Бактерии передаются человеку ин­фицированными блохами и другими эктопаразитами; в результате раз­вивается бубонная или легочная чума. Быстрое размножение бактерий в организме и интенсивная выработка ими токсина могут приводить к скорой смерти.

Анализ питьевой воды. Основная цель анализа питьевой воды - обнаружение Escherichia coli. Этот анализ-простой пример бактериологической дифферен­циальной диагностики, поэтому на нем стоит остановиться подробнее. Е. cofi-обычный и совершенно безвредный обитатель кишечника человека, и его присутствие в питьевой воде само по себе неопасно. Однако в кишечнике может находиться и ряд патогенных бактерий. Вместе с Е. coli эти бактерии выделяют­ся с калом больных, реконвалесцентов и бациллоносителей, так что и они могут попадать в питьевую воду. Чтобы не применять специальных методов для вы­явления каждой из таких патогенных бактерий, пользуются общим индикатором загрязнения. Таким индикатором и служит постоянный обитатель кишечника Е. coli. Обнаружение этого вида в пробе воды показывает, что вода загрязнена со­держимым кишечника и кишечными бактериями, среди которых могут быть и патогенные формы. В таком случае требуется принять соответствующие меры. Нормой для питьевой воды считается, когда общее число бактериальных клеток в 1 мл не превышает 100; при этом в 100 мл воды не должно быть ни одной клетки Е. coli.

Е. coli хорошо растет на средах, содержащих глюкозу или лактозу и пептон. Для того чтобы создать условия, при которых рост других бактерий сводился бы к минимуму, пользуются лактозой. На средах с лактозой могут расти только те бактерии, которые способны ее расщеплять с помощью р-галактозидазы. Этот фермент синтезируют бактерии группы кишечной палочки и молочно­кислые бактерии, тогда как многие почвенные и водные бактерии его лишены.

Первые указания на присутствие газообразующих бактерий дает появление газа во время инкубации пробы в растворе с лактозой и пептоном в бродильных трубках Эйихорна. Если в одну трубку высеять Escherichia coli, а в дру­гую - Enterobacter aerogenes, то уже после 24-часовой инкубации при 37°С станет заметной разница в выделении газообразных продуктов. Е. aerogenes оправды­вает свое название и образует примерно вдвое больше газа, чем Е. coli. Различен и состав выделяющегося газа: Е. coli выделяет Н2 и С02 примерно в соотноше­нии 1:1, тогда как Enterobacter aerogenes образует больше С02, чем водорода.

 

Image

Некоторые молочнокислые бактерии тоже обладают способностью расщеп­лять лактозу с образованием газа, так что их присутствие может исказить ре­зультаты анализа. Это делает необходимым применение дальнейших методов дифференциации. Если такую культуру высеять на агар с эозином и метиле-новым синим (лактоза-пентон-эозин-метиленовый синий), то появляются ко­лонии Е. coli, окрашенные в темно-синий цвет с металлическим отливом (резуль­тат отражения света); Enterobacter же образует розовые слизистые колонии без металлического блеска.

Для более точной дифференциации этих двух микроорганизмов требуется полный анализ брожения. Это, конечно, самый точный, но и самый трудоемкий способ. В повседневной практике для заключительной дифференциации исполь­зуют метод, основанный на качественных различиях между двумя рассматри­ваемыми видами бактерий (табл. 8.5). Учитываются следующие показатели: 1) образование индола из триптофана; 2) количество кислоты, образуемой из сахара (проба с метиловым красным); 3) образование ацетоина при сбраживании глюкозы (реакция Фогес-Проскауэра) и 4) рост на среде с цитратом в качестве источника углерода.

  • 1. Образование индола. Индол, образуемый из триптофана, выявляется с по­мощью реактива Эрлиха (и-диметиламинобензальдегида) по вишнево-красно­му окрашиванию.
  • 2. Проба с метиловым красным. Образование кислоты приводит к изменению цвета рН-индикатора (метилового красного): красный <рН 4,5 < желтый.
  • 3. Образование ацетоииа (реакции Фогес-Проскауэра). Ацетоин, образовавшийся в питательной среде с глюкозой и пептоном, в сочетании с креатином, содер­жащимся в пептоне, вызывает после прибавления сильной щелочи (1 мл 10%-ного КОН на 5 мл питательного раствора) появление красной окраски. Чув­ствительность метода повышается при добавлении креатина и а-нафтола.
  • 4. Использование цитрата. В синтетическом питательном растворе с цитратом использование последнего можно обнаружить по помутнению и подщелачи-ванию (выявляется с помощью бромтимолового синего).

Продукты брожения и метаболические пути. При брожениях, вызы­ваемых факультативными анаэробами, в том числе представителями Enterobacteriaceae, многими видами Bacillus и другими бактериями, образуется большое число различных соединений, среди которых пре­обладают органические кислоты. Важнейшими продуктами брожения являются уксусная, муравьиная, янтарная и молочная кислоты, этанол, глицерол, ацетоин, 2,3-бутандиол, С02 и молекулярный водород. Гек-созы расщепляются в основном по фруктозобисфосфатному пути и только в незначительной части-по пентозофосфатному. Разложение

 

Image

глюконата идет по 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатному пути.

В зависимости от того, какие продукты брожения выделяются в анаэробных условиях, различают два типа процессов: а) при броже­нии, характерном для Escherichia coli, образуются главным образом кис­лоты и совсем не образуется бутандиол; б) при брожении, характерном для Enterobacter, основной продукт-бутандиол, кислоты же занимают второе место. В табл. 8.6 приведены результаты типичного анализа продуктов брожения. Два указанных типа брожения различаются главным образом по реакциям, связанным с превращениями пирувата.

Особенности брожения, осуществляемого Escherichia coli. Для этой бактерии характерны следующие особенности брожения; 1) расщепле­ние пирувата с образованием ацетил-СоА и формиата; 2) разложение формиата на С02 и молекулярный водород; 3) восстановление ацетил-СоА до этанола; 4) отсутствие способности образовывать из пирувата ацетоин и 2,3-бутандиол.

Превращение пирувата в ацетил-СоА и формиат происходит только в анаэробных условиях; его катализирует пируват :формиат-лиаза (см. разд. 7.2.4). Этот фермент чрезвычайно чувствителен к кислороду, удер­живается флаводоксином в восстановленном состоянии и для своей ак­тивации нуждается в 8-аденозил-Ь-метионине.

Муравьиную кислоту большинство штаммов Е. coli и другие газо­образующие виды энтеробактерий расщепляют на С02 и молекулярный водород:

нсоон *ормцэг-гца'"ц"% н2 + со2

Зту реакцию катализирует ферментная система, называемая формиат-гидроген-лиазой. Речь идет, вероятнее всего, о комбинированном действии формиатдегидрогеназы (НСООН + X -» С02 + ХН2) и ги-дрогеназы (ХН2 -» X + Н2). У Е. coli газообразные продукты Н2 и С02 образуются почти в равных количествах. Такое стехиометрическое отношение (1:1) согласуется с образованием обоих газов в результате расщепления формиата. Однако при изменении рН это отношение меняется.

Этанол, образуемый энтеробактериями, является продуктом восста­новления ацетил-СоА. У этих бактерий нет пируватдекарбоксилазы, де-карбоксилирующей пируват с образованием ацетальдегида. Часть обра­зующегося ацетил-СоА выделяется в виде ацетата; высокоэнергетиче­ская связь может при этом сохраняться благодаря реакциям, осущест­вляемым фосфотрансацетилазой и ацетаткиназой.

Лактат получается в результате восстановления пирувата.

Сукцинат является продуктом «фумаратного дыхания», при котором происходит фосфорилирование, сопряженное с транспортом электронов (разд. 9.6). Сначала в результате карбоксилирования фосфоенолпирува-та образуется оксалоацетат, который затем через малат превращается в фумарат. Фумарат при участии мембраносвязанной фумаратредук-тазы восстанавливается до сукцината, который выделяется в окружаю­щую среду. Выделение значительных количеств сукцината (табл. 8.6), синтез которого включает фиксацию С02, позволяет объяснить то, что Escherichia coli может покрывать за счет С02 до 20% своей потребности в углероде.

Особенности брожения, осуществляемого Enterobacter aerogenes. Эта бактерия в анаэробных условиях тоже образует целый ряд кислот; в ко­личественном отношении они, однако, существенно уступают ацетоину и 2,3-бутандиолу. Ацетоин образуется из двух молекул пирувата. Про­цесс включает двукратное декарбоксилирование. Образование нейтраль­ного продукта брожения-будандиола-в известной мере конкурирует за промежуточный продукт-пируват, подавляя тем самым синтез кислот.

С другой стороны, образование бутандиола связано с дополни­тельным освобождением С02. Количество дополнительно образуемой двуокиси углерода находится в стехиометрическом соотношении с коли­чеством бутандиола. Из табл. 8.6 видно, что некоторая часть С02 обра­зуется при расщеплении формиата, однако основное ее количество вы­деляется в процессе образования бутандиола. Своим названием Enterobacter aerogenes обязан, как уже говорилось, очень интенсивному выделению газообразных продуктов. Соответствующие отличия от бро­жения, осуществляемого Escherichia coli, составляют основу для приме­нения пробы с метиловым красным и проведения реакции Фогес-Про-скауэра на ацетоин.

Образование ацетоина у Enterobacter идет через 2-ацетиллактат. Ак­тивный ацетальдегид (гидроксиэтилтиаминпирофосфат; см. рис. 7.6) участвует в реакции с пируватом, катализируемой ацетиллактатсинта-зой (ферментом I), в результате чего образуется 2-ацетиллактат:

Второй фермент (И) - 2-ацетиллактатдекарбоксилаза-отщепляет С02. Продуктом этой стереоспецифической реакции является ацетоин (ацетилметилкарбинол).

2,3-Бутандиол образуется при восстановлении ацетоина бутандиолде-гидрогеназой:

СН3- СНОН- СО-СН3   +  NADH2   -*

-*  СН3-СНОН^СНОН-СН3   +   NAD

У Enterobacter aerogenes, Bacillus subtilis, В. polymyxa, Serratia, Aeromonas hydrophila и некоторых других бактерий образование бутан-диола идет через 2-ацетиллактат. Брожение с выходом бутандиола на­ходит применение в промышленности.

При окислении ацетоина кислородом воздуха легко образуется сход­ное с ацетоином соединение диацетил. Его выделяют и различные мо­лочнокислые бактерии (Leuconostoc cremoris, Lactobacillus plantarum), до­бавляемые к молоку специально для этой цели в процессе приготовле­ния молочнокислых продуктов (масла, йогурта). Диацетил придает про­дукту запах масла. У названных бактерий он синтезируется не через 2-ацетиллактат, а из гидроксиэтил-тиаминпирофосфата и ацетил-СоА.

 
« Пред.   След. »