Масляная кислота (бутират), н-бутанол, ацетон, 2-пропанол и ряд дру­гих органических кислот и спиртов являются типичными продуктами сбраживания углеводов анаэробными спорообразующими бактериями (клостридиями). Поэтому клостридии, а также некоторые специализиро­ванные виды, сбраживающие только этанол, аминокислоты или иные вещества, рассматриваются здесь в связи с маслянокислым брожением, которое они вызывают.

Признаки. Род Clostridium относится к семейству ВасШасеае. Как и другие представители этого семейства (Bacillus, Sporolactobacillus, De-sulfotomaculum и Sporosarcina), клостридии грам-положительны. Благода­ря перитрихально расположенным жгутикам они очень подвижны. Веге­тативные клетки палочковидные, однако форма их может изменяться в зависимости от условий среды. Овальные или шарообразные эндо­споры изменяют форму палочковидной материнской клетки, так как их диаметр, как правило, больше толщины этой клетки. Споры терморези­стентны.

Физиологически клостридии отличаются резко выраженным бро­дильным типом метаболизма, а также чувствительностью к кислороду: они растут только в анаэробных условиях. Однако существуют, по-види­мому, все переходные формы-от строго анаэробных видов (Clostridium pasteurianum, С. kluyveri) до почти аэротолерантных (например, С. histolyticum, С. acetobutylicum). Клостридии, как правило, не содержат ге-мопротеинов (цитохромов, каталазы). Некоторые виды способны, одна­ко, образовывать цитохромы, если в питательной среде содержатся их предшественники. Из запасных веществ широко распространены крах-малоподобные полисахариды.

Температурный оптимум для роста большинства известных видов Clostridium лежит между 30 и 40°С Наряду с этими мезофильными представителями встречается много термофильных видов с оптимумом 60-75°С, таких как С. thermoaceticum и С. thermohydrosulfuricum. Подобно

другим представителям Bacillaceae, клостридии способны расти только при нейтральной (или щелочной) реакции среды. Поэтому их рост, ча­сто нежелательный, может быть полностью подавлен при подкислении (например, в квашеной капусте, силосе, фруктовых консервах, сырых колбасах).

Субстраты. Клостридии весьма сильно различаются в отношении субстратов, которые они могут использовать и сбраживать. Некоторые виды мало разборчивы и используют широкий круг веществ, другие уз­ко специализированы и способны сбраживать лишь один или несколько субстратов. В целом же клостридиям доступно множество различных природных соединений. Они способны разлагать полисахариды (крах­мал, гликоген, целлюлозу, гемицеллюлозы, пектины), нуклеиновые кис­лоты, белки, аминокислоты, пурины и пиримидины. Одним клостри­диям нужны сложные питательные среды или ростовые вещества, другие в них не нуждаются. Некоторые могут обходиться молеку­лярным азотом как единственным источником этого элемента; азот они связывают с большой скоростью (Clostridium pasteurianum)¹.

По способности использовать различные субстраты клостридии можно подразделить на ряд групп. Сахаролитические клостридии рас­щепляют преимущественно полисахариды или сахара. Пептолитические клостридии расщепляют белки, пептоны и аминокислоты. Группы в свою очередь объединяют на основе типов брожения и его продуктов (табл. 8.7 и 8.8).

Для получения накопительных культур видов Clostridium можно во­спользоваться некоторыми их особенностями. Поскольку их споры тер­морезистентны, инокулят предварительно пастеризуют. Создавая стро­го анаэробные условия, заранее исключают рост всех аэробных бактерий. Так как некоторые бактерии, расщепляющие полисахариды, прикреплены к поверхности частиц, например к крахмальным зернам или к частицам целлюлозы в рубце жвачных или каких-то осадках, эти частицы можно сначала промыть, чтобы освободить их от других бак­терий, а затем использовать как материал для инокуляции. Для поддер­жания способности к интенсивному брожению нужно и в последующей работе с выделенными штаммами всегда пользоваться пастеризованны­ми инокулятами.

Биохимия брожения и его продукты. При брожении образуются в раз­ных соотношениях кислоты (масляная, уксусная, молочная), спирты (бу-танол, этанол, 2-пропанол), а также ацетон и газообразные продукты (Н₂ и С0₂). Клостридии расщепляют глюкозу по фруктозобисфосфат-ному пути. Водород, освобождающийся при дегидрировании глицераль-дегидфосфата, переносится, как правило, на органические кислоты или кетоны, образуемые из пирувата или ацетил-СоА. Прототипом броже-

ния, осуществляемого клостридиями, можно считать сбраживание глю­козы Clostridium butyricum и С. acetobutylicum; при этом образуются бу­тират, ацетат, бутанол, этанол, ацетон, 2-пропанол, С0₂ и Н₂. Выход продуктов варьирует в зависимости от условий.

Масляная кислота (бутират)-продукт конденсации двух молекул аце-тил-СоА при участии тиолазы с образованием ацетоацетил-СоА и его последующим восстановлением (рис. 8.4). Ацетоацетил-СоА восстана­вливается за счет NADH₂ при участии fi-гидроксибутирил-СоА-дегидро-

t 8.8

геназы до (3-гидроксибутирил-СоА. От последнего с помощью крото-назы отщепляется вода. Кротонил-СоА под действием флавинового фермента бутирил-СоА-дегидрогеназы восстанавливается до бутирил-СоА. От бутирил-СоА с помощью СоА-трансферазы СоА может пере­носиться на ацетат; при этом освобождается масляная кислота, которая выходит в среду. Из ацетил-СоА при участии фосфотрансацетилазы и ацетаткиназы может быть получен свободный ацетат, что сопрово­ждается синтезом АТР из ADP (см. также стр. 264).

При чистом маслянокислом брожении образующийся при окислении пирувата водород выделяется в газообразном виде. Когда глюкоза сбраживается согласно уравнению

Глюкоза  -у  Бутират   +   2С0₂   +   2Н₂

баланс водорода сходится; на один моль глюкозы образуются три мо­ля АТР.

Бутанол, бутират, ацетон и 2-пропанол образуются при сбраживании глюкозы клетками Clostridium acetobutylicum. При этом вначале выде­ляется также масляная кислота; однако по мере подкисления среды (рис. 8.5) начинают синтезироваться ферменты (в том числе ацетоаце-татдекарбоксилаза), действие которых приводит к накоплению ацетона и бутанола. Процессы образования этих веществ тесно связаны между собой. В результате декарбоксилирования части ацетоацетата утрачи­вается потенциальный акцептор водорода, который при восстановлении в бутират мог бы дважды присоединить 2[Н]. Этот водород так или иначе должен быть передан другим акцепторам, в том числе и только что образовавшемуся бутирату. Для восстановления до бутанола бути­рат должен быть сначала активирован путем превращения в бутирил-СоА. Реакции, происходящие при образовании бутирата, ацетона и бу­танола, представлены на рис. 8.4. При брожении в щелочной среде (например, в присутствии СаСО_э; табл. 8.9) С. acetobutylicum ведет себя

.

как С. butyricum. Некоторые штаммы восстанавливают ацетон и выде­ляют 2-пропанол.

Этанол образуется в результате восстановления ацетил-СоА.

Молекулярный водород может происходить из NADH₂, образующе­гося как при расщеплении пирувата, так и при дегидрировании глице-ральдегидфосфата (см. стр. 265). Чем больше водорода может быть образовано при этом, тем меньше нужно синтезировать акцепторов во­дорода (ацетоацетил-СоА). Таким образом, энергия связи ацетил-СоА может быть сохранена в форме АТР. Значит, если при сбраживании глюкозы С. butyricum на один моль глюкозы образуется больше двух молей Н₂ и поэтому меньше бутирата и соответственно больше ацета­та, то выход АТР может превышать 3 моля (см. ниже о Ruminococcus).

Поскольку ацетон, 2-пропанол и бутанол служат важными органиче­скими растворителями, брожение, осуществляемое клостридиями, имеет большое техническое значение. Именно в связи с получением этих ве­ществ перед промышленносью впервые встала задача проведения ми­кробиологических синтезов в условиях, исключающих возможность вся­кого загрязнения.

Сбраживание этанола и ацетата. Из накопительных культур Methanobacterium omelianskii, содержавших в качестве субстрата этанол, была выделена анаэробная спорообразующая бактерия, которая наряду с этанолом нуждается и в ацетате. Эта бактерия -Clostridium кluyveri-превращает смесь уксусной кислоты и этанола в масляную и капроновую кислоты и молекулярный водород (рис. 8.6). Ацетат слу­жит дополнительным акцептором водорода, и он образуется в ходе брожения.   АТР   синтезируется   только   при   ацетаткиназной   реакции.

Сбраживание лактата и ацетата. Из накопительных культур, содержа­щих в качестве субстрата лактат, была выделена бактерия Clostridium tyrobutyricum, которой тоже необходим ацетат как дополнительный ак­цептор водорода, если главным субстратом служит лактат или глицерол: СН₃

С. tyrobutyricum сбраживает глюкозу по схеме, известной для С. butyricum, не нуждаясь в экзогенном акцепторе водорода.

Сбраживание глутаминовой кислоты. Из множества процессов броже­ния, при которых аминокислоты в анаэробных условиях превращаются в жирные кислоты, С0₂ и аммиак, мы рассмотрим только расщепление глутамата бактерией Clostridium tetanomorphum. Это брожение цривле-кло к себе внимание потому, что на его примере была выяснена биохи­мическая функция витамина В₁₂. С. tetanomorphum обычно выделяют из накопительной культуры с гистидином в качестве субстрата. Гистидин расщепляется через глутамат. При сбраживании глутамата образуются масляная и уксусная кислоты, аммиак, С0₂ и молекулярный водород. Путь катаболизма глутамата включает ряд необычных реакций (рис. 8.7). Сначала разрываются связи между углеродными атомами 2 и 3 и образуются связи между атомами 2 и 4, и в результате получается аминокислота- с разветвленной цепью - метиласпарагиновая кислота. В этом участвует кофермент-производное витамина В₁₂. Лишь на этой стадии происходит дезаминирование. К ненасыщенной мезаконовой (метилфумаровой) кислоте присоединяется вода, а образующаяся цитра-малевая (2-метил-яблочная) кислота расщепляется затем на уксусную и пировиноградную кислоты. Уксусная кислота выделяется, а пировино-градная рассмотренным выше путем превращается в масляную кислоту и С0₂.

Сопряженное сбраживание двух аминокислот (реакция Стикленда). Пептолитические клостридии (табл. 8.7, V) гидролизуют белки и затем используют аминокислоты. Многие аминокислоты сбраживаются толь-

ко вместе с какими-нибудь другими. Как установил Стикленд (1934), Clostridium sporogenes быстро сбраживает смесь аланина и глицина, но не может использовать ни ту ни другую из этих аминокислот в отдель­ности. Судя по суммарному уравнению

Алании  +  2 Глицин  +  2Н₂0 -► 3 Ацетат +  3NH₃  +  С0₂ аланин служит донором водорода, а глицин-акцептором:

СН₃-CHNH₂-СООН  +  2Н₂0 -* СН₃СООН  + NH₃  +

+ С0₂  + 4[Н] 2CH₂NH₂-СООН  + 4[Н] - 2СН₃-СООН  +  2NH₃

Источником энергии, очевидно, служит сопряженная реакция окисле­ния-восстановления. Роль донора водорода могут выполнять, напри­мер, аланин, лейцин, изолейцин, валин, серии, метионин и т.д. Акцепто­рами водорода могут служить глицин, пролин, аргинин, триптофан и т.д. Аминокислота-донор дезаминируется в оксокислоту, которая за­тем в результате окислительного декарбоксилирования превращается в жирную кислоту. Этот этап сопряжен с фосфорилированием и, таким образом, представляет собой реакцию, доставляющую энергию. Водо­род, перенесенный при этом на ферредоксин, снова связывается при вос­становительном дезаминировании аминокислоты-акцептора. Однако не все аминокислоты используются всеми пептолитическими клостридия-ми.

Маслянокислое и уксуснокислое (ацетатное) брожение¹, осуществляе­мое неспорообразующими бактериями. Некоторые роды анаэробных бак­терий близки к клостридиям по продуктам брожения; они, однако, не образуют спор, и многие из них грам-отрицательны. Большинство та­ких бактерий, образующих масляную и уксусную кислоты, было выде­лено из рубца, где они участвуют в разложении целлюлозы, крахмала и других углеводов. Они выделяют много молекулярного водорода и СО ₂ и создают метаногенным бактериям условия для образования ме­тана. Из бактерий рубца, образующих масляную кислоту, следует особо упомянуть Bytyrivibrio fibrosolvens, а из обитающих в рубце продуцентов уксусной кислоты -Ruminococcus albus. Этот последний вид-строгий анаэроб, использующий целлюлозу и ксилан, а также многие сахара. Он способен превращать 1 моль глюкозы в 2 моля ацетата, 2 моля С0₂ и 4 моля Н₂-правда, при условии, что концентрация выделенного водо­рода поддерживается на низком уровне. Это возможно в смешанной культуре с какой-либо бактерией, использующей водород, например Vibrio succinogenes (рис. 8.8). Из приведенной схемы видно, что при чис­том ацетатном брожении может быть образовано 4 моля АТР на 1 моль глюкозы. Столь высокая эффективность регенерации АТР воз­можна, однако, лишь в том случае, если все возникающие при расщеп­лении глюкозы восстановительные эквиваленты будут освобождаться в виде молекулярного водорода (см. выше).

Клостридии - возбудители болезней и продуценты токсинов. Неко­торые пептолитические клостридии могут быть возбудителями болез­ней при раневой инфекции (газовая гангрена и столбняк), а также причи­ной пищевых отравлений. Споры их очень распространены в почве. Если споры Clostridium histolyticum или С. septicum попадают в откры­тую рану, к которой нет доступа воздуха или где аэробные бактерии,

потребляя кислород, создают анаэробные условия, то эти клостридии начинают расти, расщеплять с помощью протеиназ коллаген и другие белки, вызывать образование дурно пахнущих продуктов брожения и газа. С такого рода газовой гангреной («госпитальной гангреной») в прежние времена можно было бороться только путем ампутации по­раженной конечности. С раневой инфекцией связан и до сих пор еще не­редко встречающийся столбняк. Его вызывает Clostridium tetani. Эта бактерия при своем росте выделяет очень сильный нейротоксин, вызы­вающий тонические судороги мышц.

Наиболее тяжелую форму пищевого отравления - ботулизм - вызы­вает Clostridium botulinum. Это широко распространенная почвенная бак­терия, которая может развиваться в недостаточно простерилизованных мясных продуктах и бобовых консервах. Она получила свое название потому, что встречается в колбасе (лат. botulus - колбаса). Образуемый ею токсин в случае потребления зараженного продукта может вызвать смерть вследствие нервного паралича, в частности паралича дыхания. Токсин этот, к счастью, термолабилен и быстро (за 15 мин) инактиви-руется при кипячении.