: Главная arrow Рост микроорганизмов arrow Методы определения числа бактерий и бактериальной массы  

Методы определения числа бактерий и бактериальной массы

Печать E-mail
 

 

Во время роста периодической (статической) бактериальной культуры может не быть строгой пропорциональности между увеличением числа клеток и увеличением бактериальной массы. Поэтому показатели эти необходимо различать.

Определение числа бактерий. В популяции бактерий не все клетки жизнеспособны. Живыми считаются те клетки, которые могут обра­зовывать колонии на (или в) агаризованной среде либо суспензию в пи­тательном растворе. Эти жизнеспособные клетки выявляют спе­циальными методами, предназначенными для определения числа живых клеток. В общее же число клеток включают все видимые или иным спо­собом выявленные клетки; сюда, следовательно, входят также мертвые или поврежденные клетки.

Общее число клеток. 1. Самым распространенным методом определения об­щего числа клеток служит их подсчет под микроскопом в тонком слое с по­мощью «счетной камеры» (например, по Нейбауэру, Тома или Петрову-Хаузе-ру). Если толщина слоя 0,02 мм, а сторона квадрата 0,05 мм (объем 5 • 10 ~ 8 см3), то для того, чтобы определить число клеток в 1 мл, следует найденное их число умножить на 2-107. 2. Один из самых старых методов состоит в сравнении с из­вестным числом каких-либо других малых частиц, например эритроцитов (около 5 • 106 эритроцитов на 1 мл). 3. Значительно облегчает работу применение элек­тронного счетчика («счетчика Каултера»). Действие его основано на снижении проводимости раствора электролитов при прохождении одной бактерии через узкое отверстие. 4. Если на 1 мл приходится менее 106 клеток, для определения их числа пригоден метод мембранных фильтров. Морскую, прудовую или пить­евую воду пропускают через мембранный фильтр, а затем этот фильтр сушат, окрашивают,  просветляют  и  производят  подсчет   клеток   под   микроскопом.

Число живых клеток. Обычно подсчитывают число колоний, образуемых жизнеспособными клетками в благоприятных для роста условиях. Если поль­зуются чашечным методом Коха, то равные доли соответственно разбавленной гомогенной суспензии клеток смешивают с расплавленной агаризованной сре­дой (40-45°С) и выливают на чашки Петри. Можно также размазать суспензию по поверхности агара в чашке Петри с помощью (треугольного) шпателя Дри-гальского или же осадить клетки после фильтрования на агаризованную срду или на картонные диски с питательной средой. Во всех случаях после надлежа­щей инкубации подсчитывают число колоний. Применение чашечного метода Коха, а также различных его  модификаций предусматривает подсчет клеток одного вида из гомогенных суспензий; эти методы непригодны для подсчета клеток разных видов из смешанных популяций.

Определение бактериальной массы. Выбор метода для определе­ния бактериальной массы зависит от того, с какой целью это определе­ние производится. Для оценки урожая обычно взвешивают сырые или сухие отцентрифугированные клетки. При определении интенсивности обмена или ферментативной активности исходят из содержания в клет­ках белка или азота. Часто выбор метода диктуется такими соображе­ниями, как простота или быстрота работы. В повседневной практике предпочтение отдается не прямым, а косвенным методам (после со­ответствующей калибровки).

Прямые методы. 1. Сырую биомассу определяют после осаждения кле­ток центрифугированием. После центрифугирования отмытых клеток можно определить сухую массу. Оба метода не свободны от довольно больших систе­матических ошибок. 2. Гораздо большую точность обеспечивает определение общего азота (метод микро-Кьельдаля и микродиффузионный метод определе­ния аммиака), а также определение общего содержания углерода (по ван Слай-ку-Фолчу). 3. В повседневной практике часто определяют содержание бакте­риального белка. Хорошие результаты дают модификации биуретового метода и другие колориметрические методы. Микрометоды основаны на измерении ко­личества характерных компонентов белка: тирозина, триптофана (по Лоури или Фолину).

Косвенные методы. 1. Для определения клеточной массы весьма полезны методы, основанные на измерении мутности клеточных суспензий. На практике обычно определяют оптическую плотность суспензии (измерение экстинкции, турбидиметрия). Для некоторых целей более точные результаты дает определе­ние светорассеяния (нефелометрия). Однако прямая (линейная) зависимость ме­жду обоими этими показателями и бактериальной массой наблюдается лишь при очень низких плотностях клеточных суспензий. Поскольку рассеяние света зависит от диаметра, формы и показателя преломления рассеивающих частиц, в том числе клеточных включений, приходится от случая к случаю проверять со­отношение между оптическими величинами и более прямыми показателями, та­кими как сухая биомасса, содержание в ней азота или содержание углерода. 2. Показатели интенсивности метаболизма, непосредственно связанные с ростом (поглощение 02, образование С02 или кислот), могут служить адекватной ме­рой бактериальной массы. К такого рода определениям прибегают в тех слу­чаях, когда другие методы оказываются непригодными, например при очень малой плотности клеточных суспензий. Для измерения можно применять титро-метрические, манометрические, электрохимические и другие методы.

 
« Пред.   След. »