: Главная arrow Регуляция метаболизма arrow Мутанты с нарушенной регуляцией  

Мутанты с нарушенной регуляцией

Печать E-mail
 

 

Выяснение механизмов, регулирующих биосинтез ферментов и их ак­тивность, стало возможным благодаря выделению мутантов с дефекта­ми регуляции. Выделены мутанты нескольких типов, в том числе: 1) не образующие функционально полноценного репрессорного белка или со­держащие его в сильно повышенном количестве; 2) с оператором кон­ститутивного типа, который не способен связывать репрессорный бе­лок; 3) с аллостерической нечувствительностью, у которых опреде­ленный фермент не может распознавать эффектор. Мы опишем некоторые методы,  с  помощью  которых  выделяют таких  мутантов.

Мутанты, конститутивно образующие катаболические ферменты. На­копительные культуры такого рода мутантов можно получить путем частой смены субстратов. Если клетки конститутивно образуют фер­менты, необходимые для использования субстрата А, то после переноса клеточной популяции с субстрата В на субстрат А они точас начинают расти с максимальной скоростью; клеткам же индуцибельного дикого типа для достижения максимальной скорости роста необходима опреде­ленная лаг-фаза (чтобы синтезировать ферменты для роста на субстрате А). После ряда генераций клетки снова переносят на среду с субстратом В и дают им расти до тех пор, пока ферменты, участвующие в исполь­зовании субстрата А, не будут достаточно сильно «разбавлены». После многократного повторения такой процедуры конститутивные мутанты сильно обгоняют в росте клетки дикого типа с индуцибельными фер­ментами. Таким путем были выделены, например, мутанты Е. coli, кон­ститутивно образующие ферменты, необходимые для использования лактозы. В других методах отбора пользуются таким приемом, как подавление индукции при помощи структурных аналогов субстрата. Метилтиогалактозид может, например, подавить у Escherichia coli ин­дукцию да/-оперона, вызываемую галактозой.

Мутанты, конститутивно образующие анаболические ферменты. Эти мутанты, а также мутанты с нарушениями тонкой регуляции процессов биосинтеза могут быть выделены с помощью антиметаболитов. Многие антиметаболиты (разд. 6.6), будучи структурными аналогами нор­мальных конечных продуктов биосинтеза (аминокислот, пиримидинов и т.п.), оказывают бактериостатическое действие. Имитируя конечный продукт, они, с одной стороны, нарушают синтез нормальных метабо­литов, а с другой - включаются в белки или нуклеиновые кислоты, в ре­зультате чего образуются макромолекулы, неспособные выполнять нор­мальные функции. Ингибирование таким «ложным» конечным продук­том приводит к остановке роста. Если на агаризованную среду с антиметаболитом высеять популяцию дикого типа (108-1010 клеток), то способность к росту и образованию колоний проявят только от­дельные устойчивые мутанты.

В основе подобной устойчивости к антиметаболитам могут лежать разнообразные изменения физиологических свойств клетки, обусло­вленные мутациями. Рассмотрим типы таких мутаций.

  • 1. Мутации, приводящие к «аллостерической нечувствительности». При такого рода мутации ни метаболит, ни антиметаболит не может подавить активность первого (аллостерического) фермента данного пу­ти биосинтеза. В результате образование соответствующего конечного продукта не регулируется.
  • 2. Мутации, приводящие к конститутивной дерепрессии. Следствие такой мутации-неконтролируемое образование ферментов, участвую­щих в синтезе конечного продукта.
  • 3. Мутации, затрагивающие каталитические центры ферментов, ак­тивирующих метаболиты и участвующих в их превращениях. Вследствие повышения избирательности фермент может утратить способ­ность связывать антиметаболит вместо метаболита. После этого антиметаболит уже не будет оказывать бактериостатического действия.
  • 4. Мутации, приводящие к нарушению транспортных процессов. В результате таких мутаций антиметаболиты перестают поступать внутрь клетки и потому не могут уже влиять на ее метаболизм.
  • 5. Мутации, обусловливающие конститутивное расщепление антиме­таболитов. При этом клетка разрушает антиметаболит и тем самым обезвреживает его. С точки зрения отбора мутантов с нарушенной регу­ляцией интерес представляют только первые два типа мутаций. Дере-прессия синтеза анаболических ферментов и утрата способности подчи­няться аллостерическому ингибированию часто приводит к «перепро­изводству» и выделению в среду конечного продукта данного биосинте­тического пути (метаболита). Для мутантной клетки это существенно потому, что метаболит вытесняет антиметаболит из реакции, обеспечи­вая таким образом рост клеток и образование колоний. Образующийся в избытке метаболит выделяется, диффундирует в агар и в зоне диффу­зии устраняет влияние антиметаболита на клетки дикого типа. Такие клетки начинают расти и образуют мелкие колонии; их называют вто­ричными или сателлитными колониями. Центральную же колонию образуют клетки мутанта, выделяющего метаболит (рис. 16.15). Рост сателлитов указывает на то, что произошла мутация, нарушившая нор­мальную работу регуляторных механизмов. Но для того, чтобы устано­вить, какого рода дефектом обусловлено накопление и выделение мета­болита, в каждом случае требуется специальный анализ.

С помощью метода, основанного на применении антиметаболитов, уже выделено много мутантов с дефектами регуляции. При сравнении различных мутантов выяснилось, что утрата механизма репрессии мень­ше влияет на скорость синтеза конечного продукта, чем изменение спо­собности к аллостерическому ингибированию. У мутантов, не спо­собных к ингибированию определенного пути биосинтеза, конечный продукт этого пути накапливается в клетке и часто выделяется в среду, несмотря на вполне нормальную репрессию. Напротив, у мутантов со значительной дерепрессией (конститутивностью) отмечается лишь очень небольшое накопление и выделение конечного продукта, если он оказы­вает нормальное ингибирующее действие.  Таким образом,  репрессия

 

Image

важна в первую очередь для уменьшения затрат, связанных с синтезом мРНК и белка, тогда как синтез метаболитов регулируется путем инги-бирования конечным продуктом.

Мутанты с измененной чувствительностью к эффектору. Мутантов, у которых изменена чувствительность какого-нибудь аллостерического фермента к эффектору, можно также выделять с помощью совершенно иного принципа, а именно как ревертантов к ауксотрофии. При этом поступают следующим образом. Сначала выделяют мутантов с дефек­том регуляции, ауксотрофных в отношении метаболита, который хотят получить как конечный продукт, накапливающийся в среде. Затем среди этих ауксотрофных мутантов отбирают таких, у которых неспособность к синтезу данного метаболита обусловлена дефектом в аллостериче-ском ферменте соответствующего пути биосинтеза. После этого из по­лученной мутантной популяции выделяют прототрофных ревертантов, которые не нуждаются в этом конечном продукте, так как сами спо­собны его синтезировать. Среди ревертантов отбирают тех, которые выделяют нужный продукт в среду. Их можно выявить биоавтографиче­ским методом (разд. 10.2.2) или распознать по росту сателлитных коло­ний. О таком мутанте, полученном в результате двукратного отбора, можно составить себе следующее представление. У него после первой мутации перестал функционировать каталитический центр одного из ал-лостерических ферментов. Вторая мутация затронула структуру (кон-формацию) всей белковой молекулы, в результате чего каталитическая активность фермента восстановилась, но аллостерическая чувствитель­ность оказалась утраченной. Как в этом, так и во многих других слу­чаях для выделения желательного мутанта необходим ряд этапов, включающих мутагенез и отбор.

Теоретические и прикладные аспекты. Стратегия отбора мутантов весьма важна для дальнейшего изучения клеточного метаболизма и для выяснения механизмов регуляции. Вместе с тем эта стратегия имеет и практическое значение, так как именно она определяет пути целена­правленного отбора высокоактивных продуцентов всех тех веществ, ко­торые могут быть получены с помощью микроорганизмов.

 
След. »