Скорость ферментативной реакции, т.е. количество субстрата, превра­щаемое в единицу времени (как правило, в микромолях субстрата, пре­вращенного за 1 мин), зависит как от концентраций фермента (Е) и суб­страта (S) или продукта (Р), так и от сродства фермента к субстрату (К_т), а также от максимальной скорости реакции (и_тах). К_т-это так называемая константа Михаэлиса-Ментен; она равна той концентра­ции субстрата, при которой активность фермента составляет половину максимальной (и_тах/2). Максимальная скорость реакции достигается при избытке субстрата, т. е. тогда, когда фермент насыщен субстратом. К_т и и_тах- кинетические параметры фермента.

Простые ферменты. Для большинства ферментов характерна гипер­болическая кривая насыщения субстратом. Скорость реакции зависит только от концентраций субстрата и продукта и гиперболически возра­стает с повышением концентрации субстрата, т.е. удовлетворяет усло­виям соотношения Михаэлиса-Ментен. Такие ферменты называют про­стыми или «гиперболическими» ферментами (рис. 16.9, А, черная кри­вая).

Понятно, что при высокой концентрации субстрата фермент перера­батывает его быстрее, чем при более низкой концентрации. Насколько чувствительно реагирует фермент на изменение концентрации субстра­та, зависит от крутизны кривой его насыщения субстратом. Чем круче кривая, тем больше повышается скорость реакции при незначительном сдвиге концентрации субстрата. Как видно из рис. 16.9, А, крутизна кри­вой и соответственно чувствительность больше всего при низких кон­центрациях субстрата. Из этих рассуждений ясно, что скорость оборота

веществ в клетке зависит от их концентрации. Как правило, субстраты ферментов (метаболиты) содержатся в клетке в концентрациях ниже К_т.

Регуляторные ферменты. Свойства регуляторных ферментов намного более сложны. Кривые насыщения субстратом для большинства этих ферментов отклоняются от гиперболической формы и часто становятся сигмоидными (рис. 16.9, А и J5). У таких кривых имеется область значи­тельно большей крутизны, чем у кривых насыщения для простых фер­ментов. В этой области, примерно между ¹/₂ и 1 */₄ К_т, регуляторные ферменты очень чувствительны-даже небольшого изменения концен­трации субстрата достаточно, чтобы сильно изменить скорость реакции.

Сигмоидная форма кривой указывает на то, что фермент построен из субъединиц, между которыми существуют кооперативные взаимодей­ствия. Очевидно, связывание субстрата с каталитическим центром одной из субъединиц фермента повышает сродство к субстрату других участков связывания в той же молекуле. Регуляторные ферменты со­стоят из двух или более, чаще всего из четырех, субъединиц.

Кроме каталитических центров, распознающих и связывающих суб­страты, у регуляторных ферментов есть и другие стереоспецифические участки-так называемые аллостернческие центры. Это места связывания эффекторов, изменяющих сродство фермента к субстрату. Имеются особые участки для связывания положительных эффекторов (активато­ров) и для отрицательных эффекторов (ингибиторов). Под влиянием эф­фекторов изменяется форма кривой насыщения (степень ее «сигмоидности» (рис. 16.9, Б). Говорят не только об аллостерических центрах, но

также об аллостерическом торможении и аллостерических ферментах

(термины «аллостерические ферменты», «регуляторные ферменты» и «сигмоидные ферменты» часто употребляют как синонимы).

Степень кооперативности выражают с помощью коэффициента кооператив-ности (или коэффициента Хилла) п. Он соответствует числу зависимых друг от друга областей связывания или числу субъединиц, участвующих в кооператив­ной реакции. При отсутствии кооперативности п = 1. Для аллостерического фер­мента, состоящего из четырех субъединиц, возможны значения и > 1 и п < 4 в за­висимости от степени положительной кооперативности. При отрицательной кооперативности п < 1. Кроме того, имеются более сложные системы, на ко­торых мы здесь останавливаться не будем.

Модели кооперативности. Попытки объяснить кооперативность ме­жду субъединицами ферментов, проявляющуюся в сигмоидной форме кривой насыщения субстратом, сводятся к двум гипотезам: «симме­тричной» модели (Моно и сотр.) и «последовательной» модели (Кош-ленд); они схематически представлены на рис. 16.10.

В основу обеих моделей положено представление о том, что фер­менты могут существовать в различных формах-в активной форме (с высоким сродством к субстрату) и в неактивной (с малым сродством к субстрату). В каком соотношении между собой будут находиться раз­ные формы фермента, зависит от наличия и концентрации лигандов (молекул субстрата, активаторов и ингибиторов). Разница между гипо­тезами касается того, как происходит конформационное изменение.

Согласно симметричной модели, фермент представлен только двумя конформационными состояниями, находящимися в динамическом рав­новесии. При этом все субъединицы данной молекулы фермента нахо­дятся в одной и той же конформации; промежуточных состояний нет, существуют только симметричные олигомеры (рис. 16.11). Равновесие характеризуется аллостерической постоянной L. В отсутствие лигандов, как правило, неактивное основное состояние Т (от англ. tense-напря­женный) преобладает над активным состоянием R (от англ. relaxed-расслабленный). При добавлении лигандов они реагируют с теми моле-

кулами фермента, которые находятся в соответствующей конформации: ингибиторы-с молекулами в состоянии Т, субстраты и активаторы-с молекулами в состоянии R. При связывании субстрата фермент удержи­вается в состоянии R. Чтобы восстановить равновесие между двумя конформационными состояниями, часть других молекул фермента тоже переходит в состояние R. Поскольку каждая молекула имеет несколько участков для связывания субстрата, небольшого числа молекул субстра­та достаточно для того, чтобы привести намного большее число таких участков в состояние высокой каталитической активности; таким обра­зом, облегчается связывание и других молекул субстрата. В этом и со­стоит кооперативный эффект, определяющий сигмоидную форму кри­вой «концентрация субстрата-скорость реакции». Отрицательный эф­фектор оказывает обратное действие.

В последовательной модели предполагается, что фермент приобре­тает каталитически активную конформацию только в результате взаи­модействия с субстратом (рис. 16.10). Если фермент состоит из несколь­ких субъединиц, то конформационное изменение одной из них, вызванное субстратом, последовательно передается другим субъедини­цам и облегчает им связывание добавочных молекул субстрата. Воз­можно образование несимметричных олигомеров (на рис. 16.10 это те-трамеры) с субъединицами, имеющими разную конформацию. Присут­ствие активаторов способствует переходу в активную форму, а от­рицательные эффекторы его затрудняют.

Аллостерические ферменты и эффекторы. Регуляторные ферменты, как правило, имеются в каждом пути биосинтеза и в некоторых путях катаболизма. В большинстве случаев они находятся в начале цепи био­синтеза и занимают, таким образом, ключевую позицию.

Аллостерические эффекторы представляют собой низкомолеку­лярные соединения - это либо конечные продукты биосинтеза, либо ве­щества, концентрация которых может отражать состояние клеточного метаболизма, например ATP, ADP, AMP, ацетил-СоА, фосфоенолпиру-ват и NADH-,.

Изменение  активности  ферментов путем  ковалентной  модификации.

Для небольшого числа ферментов известен регуляторныи механизм иного типа: они могут изменяться под действием других ферментов. Это изменение может приводить к повышению или снижению активно­сти фермента. Оно может состоять в аденилировании, фосфорилирова-нии или ацетилировании. Речь идет об относительно быстром процессе. У млекопитающих под воздействием ферментов активируются и инак-тивируются гликогенфосфорилаза и гликогенсинтетаза. У Escherichia coli не только подавляется образование глутаминсинтетазы, но и актив­ность имеющегося фермента за несколько минут снижается на 80-90%, если в питательную среду добавить ионы аммония. Это снижение ак­тивности обусловлено катализируемой особым ферментом химической модификацией: активная глутаминсинтетаза а в результате ее аденили-рования превращается в неактивную глутаминсинтетазу Ь (рис. 16.12). Наличие глутамина в клетке стимулирует аденилирующий фермент, а свободный 2-оксоглутарат оказывает противоположное действие. Пос­ле удаления из среды ионов аммония в клетках создается недостаток глутамина, и глутаминсинтетаза вновь реактивируется в результате от­щепления групп адениловой кислоты (AMP) под действием деаденили-рующей системы.