Спонтанные мутации

В популяции бактерий без всякого экспериментального вмешательства регулярно возникают мутации; такие мутации называют спонтанными мутациями, а клетки, в которых они возникли,-спонтанными мутанта­ми. Мутагенное действие аналогов оснований ДНК (см. ниже) указывает на возможные причины спонтанных мутаций: вероятно, речь идет о случайных ошибках при включении нуклеотидов во время репликации ДНК-ошибках, вызванных таутомерным перемещением электронов в основании. Тимин, например, обычно находится в оксо-форме, в кото­рой он образует водородные связи с аденином. Но если тимин во время спаривания оснований при репликации ДНК переходит в енольную форму, то он спаривается с гуанином. В результате в новой молекуле ДНК на том месте, где раньше находилась пара А-Т, появляется пара G-C.

Доля мутантов в популяции и частота мутирования. Численная доля мутантов в клеточной -популяции для разных признаков различна и варьирует в пределах от 10 ~⁴ до 10" ^и. Она зависит от частоты воз­никновения мутаций, условий среды, возраста клеточной суспензии и других факторов. Вероятность возникновения определенных мутаций в расчете на одну клетку и на одну генерацию называют частотой мути­рования. При высоких скоростях роста она постоянна, и ее обычно определяют для клеток в экспоненциальной фазе роста при опти­мальных условиях среды. Частота спонтанных мутаций для определен­ного гена составляет величину порядка 10" ⁵, а для определенной пары нуклеотидов 10 ~ ⁸.

«Молчащие» мутации. Если под мутацией в традиционном смысле понимают внезапное изменение признака, т.е. изменение генотипа, про­являющееся в фенотипе, то на молекулярном уровне любое стабильное наследуемое изменение ДНК рассматривают как мутацию. Однако вви­ду вырожденности генетического кода понятно, что не всякая мутация такого рода будет проявляться в фенотипе. Во многих триплетах изме­нение третьего основания остается без последствий («молчащие» мута­ции). Даже замена первого или второго основания триплета не всегда приводит к серьезным последствиям. Хотя структуры высшего порядка (третичная и четвертичная) определяются первичной структурой белка (т.е. последовательностью аминокислот), разные аминокислоты играют в этой структуре не одинаково важную роль. Например, мутация AUC->GUC ведет к замене изолейцина валином, т.е. к замене одной липофильной группы на другую. Однако мутация CUU->CCU приве­дет к замене лейцина пролином, и последствием такой замены будет от­клонение от нормальной пространственной конфигурации полипептид­ной цепи, что может сильно изменить структуру высшего порядка. Из этого понятно, что различные мутации в одном и том же структурном гене определенного фермента могут по-разному сказываться на его ак­тивности: возможны любые изменения-от едва заметного снижения ка­талитического действия до полной инактивации.

Обратные мутации и реверсии. Из сказанного выше становится ясно, что у мутанта может произойти обратная мутация, в результате кото­рой восстановятся свойства дикого типа. Об истинной обратной мута­ции говорят лишь в тех случаях, когда вторая мутация точно восстана­вливает исходный генотип, т.е. когда измененный при первой мутации триплет будет вновь кодировать ту же аминокислоту, что и раньше. Ее ли же дело сводится к восстановлению исходного фенотипа (например, к возобновлению синтеза нормально функционирующего фермента), то говорят о реверсии или супрессорной мутации и соответственно о ревер-тантах. Супрессорные мутации могут происходить как в исходном гене, так и в каких-либо других участках хромосомы (интрагенные и эк­страгенные супрессорные мутации).

Индуцированные мутации

Обрабатывая клетки мутагенными (вызывающими мутации) вещества­ми, можно повысить частоту мутаций. В этом случае говорят об индук­ции мутаций, а полученные при этом клетки называют индуцированны­ми мутантами. Мутагенами могут быть химические, физические или биологические агенты. Механизм их действия будет пояснен на ряде примеров.

В отношении генетической структуры различают три класса мутан­тов со следующими дефектами: 1) одна пара оснований заменена дру­гой, например вместо AT может быть GC или наоборот; 2) включена дополнительная пара оснований в нуклеотидную последовательность или утрачена одна из существовавших пар; 3) группа оснований или да­же генов может быть утрачена (делеция), перемещена в пределах хромо­сомы (транспозиция) или «разорвана» путем вставки посторонней ДНК (инсерция).

Для мутаций класса 1, называемых также точечными мутациями, характерна высокая частота реверсии. В случае мутаций класса 2, к ко­торым относятся также мутации со сдвигом рамки (см. рис. 15.4), ревер-танты редки, а после мутаций класса 3 (за некоторыми исключениями) ревертанты не появляются.

В последующих разделах мы остановимся на некоторых механизмах мутагенеза.

Включение аналогов оснований. Аналоги оснований - это антиметабо­литы. Некоторые аналоги настолько сходны с нормальными пиримиди-новыми и пуриновыми основаниями, что поглощаются клетками и включаются в ДНК. Здесь они в значительной степени выполняют функцию нормальных оснований, но в отличие от них обнаруживают большую тенденцию связывать «ложного» (неподходящего) партнера при репликации ДНК. Для вызывания мутаций часто используются бромурацил и 2-аминопурин. Бромурацил представляет собой соедине­ние, аналогичное по структуре тимину, которое включается вместо него в цепь ДНК как партнер аденина (рис. 15.3). Бромурацил таутомери-зуется в енольную форму чаще, чем тимин. При репликации цепи, со­держащей бромурацил, он в енольной форме спаривается как цитозин, т.е. вызывает включение гуанина вместо аденина. Таким образом, в не­которых случаях пара оснований AT заменяется на CG. 2-Аминопурин включается в ДНК вместо аденина и действует подобным же образом. Этот вид изменений - замену одного пурина другим пурином (A->G)

или одного примидина другим пиримидином (С-> Т) - называют тран-зицией.

Химическое изменение оснований. Некоторые мутагенные вещества действуют путем химического изменения содержащихся в ДНК основа­ний, что приводит к ошибкам репликации. Вполне понятное изменение вызывает нитрит. Азотистая кислота дезаминирует аденин, гуанин или цитозин без разрыва или каких-либо других изменений полинуклеотид-ной цепи. В результате замещения аминогруппы гидроксильной группой аденин превращается в гипоксантин и спаривается с цитозином вместо тимина, что приводит к мутации AT -► GC. Если цитозин дезаминирует-ся в урацил. то он спаривается с аденином вместо гуанина, и это ведет к мутации GC -»AT. Будучи превращен в ксантин, гуанин по-прежнему спаривается с цитозином, т. е. дезаминироваиие G не вызывает мутации. Гидроксиламин вступает в реакцию главным образом с цитозином и из­меняет его так, что тот спаривается с аденином; значит, он тоже вызы­вает мутации CG->TA.

Алкилирующие агенты. Этил- и метилметансульфонат, диметил-и диэтилсульфат, этиленимин, азотистый или серный иприт, а также N-метил-1ЧГ'-нитро-]ЧГ-нитрозогуанидин принадлежат к наиболее эффек­тивным мутагенам. Например, этилметансульфонат этилирует преиму­щественно атом N гуанина. Образовавшийся 7-алкилгуанин отщепляет­ся от цепи, в результате чего в ней образуется «пропуск». При очередной репликации на этом месте часто оказывается «ошибочное» основание.

Включение или утрата отдельных пар оснований. Профлавин и другие акридиновые красители действуют по-иному. Вероятно, молекула акридина внедряется между соседними основаниями цепи ДНК и увели­чивает расстояние между ними (интеркаляция). Такое пространственное изменение при репликации ДНК может вызывать ошибки двух типов-

утрату нуклеотида или включение дополнительной пары нуклеотидов. Мутации этого типа приводят к очень серьезным последствиям, так как при этом нарушается порядок считывания информации при синтезе бел­ка: начиная с места утраты или включения нуклеотида, информация считывается в «неправильных» триплетах (мутация «со сдвигом рамки», рис. 15.4).

Ультрафиолетовые лучи и ионизирующее излучение. УФ-свет, рентге­новские лучи и другие виды ионизирующего излучения оказывают на микроорганизмы как подавляющее жизнедеятельность (летальное), так и мутагенное воздействие. Их специфическое действие еще мало изуче­но. Исходя из совпадения кривой поглощения нуклеиновых кислот и кривой подавления жизнедеятельности клеток при облучении в зави­симости от длины волны, а также частоты мутаций в популяции, можно сделать вывод о том, что УФ-лучи действуют в основном на нуклеи­новые кислоты. Наиболее эффективны лучи ближней УФ-области с дли­ной волны около 260 нм (рис. 15.5). Побочные повреждения при этом незначительны. Поражаются главным образом пиримидиновые основа­ния. Например, два соседних тиминовых основания в ДНК могут ока­заться ковалентно связанными. Наличие таких димеров тимина служит затем источником ошибок при репликации (рис. 15.6).

Репарация ДНК. На подвергнутых УФ-облучению бактериях было показано, что повреждения ДНК частично обратимы. Если облучить бактериальную сус­пензию большой дозой ультрафиолета, то значительная доля клеток подверг­нется летальному повреждению (в них возникнут летальные мутации); при нача­той сразу же инкубации в темноте лишь немногие клетки образуют колонии. Но если непосредственно после УФ-облучения воздействовать на клетки светом бо-

лее длинноволновой области (320-550 нм), то доля выживших клеток возрастет в несколько десятков раз. В такой фотореактивации участвует фермент, активи­руемый светом и восстанавливающий нормальную структуру ДНК путем рас­щепления образовавшихся димеров тимина. Есть и другой репаративный меха­низм, не требующий участия света. При этой темповой реактивации дефектные участки цепи ДНК вырезаются и заменяются новыми нуклеотидами. Степень эффективности такой репарации лучевых повреждений у разных штаммов бакте­рий неодинакова. Устойчивость к облучению, характерная для некоторых бакте­рий (например, Micrococcus radiodurans), обусловлена высокоэффективным меха­низмом репарации.

Мутации, вызываемые транспозонами. В генетике бактерий все боль­шее значение приобретает метод получения мутаций с помощью транс-позонов. Транспозоны (Тп) представляют собой короткие двойные цепи ДНК, которые состоят из более чем 2000 пар оснований и обычно обус­ловливают устойчивость к одному антибиотику, в исключительных слу­чаях-к нескольким. Транспозоны способны «перепрыгивать» из одного участка генома в другой, в частности из бактериальной хромосомы в плазмиду и обратно; таким образом, они могут включаться в раз­личные участки генома (см. разд. 15.3.1). В случае внедрения транспозо-на в какой-либо структурный ген хромосомы нуклеотидная последова­тельность этого гена будет нарушена и генетическая информация не сможет транслироваться в функционально полноценный полипептид. Возникнет инсерционный мутант.

Поскольку транспозоны не способны к автономной репликации, для переноса их из одной бактериальной клетки в другую необходим так называемый вектор (переносчик). Векторами могут служить плазмиды или бактериофаги. Следует упомянуть, что колифаг мю («фаг-мута-тор»), подобно транспозону, обладает способностью внедряться в раз­личные участки бактериальной хромосомы и вызывать мутации. По этой причине фаг мю был назван «гигантским транспозоном», и его ис­пользуют в повседневной практике получения мутантов Е. coli.

Проявление признаков. Уже возможность фотореактивации после УФ-облучения указывает на то, что первичный эффект при воздействии мутагенного фактора не обязательно ведет к истинной мутации. Вклю­чение бромурацила в цепь ДНК или димеризация тимина представляет собой лишь премутацию; димеризация тимина - процесс обратимый, и в случае фотореактивации дело не доходит до возникновения мутанта. Только при последующей редупликации премутировавшей цепи ДНК первичное повреждение становится стабильным и в дальнейшем пере­дается потомству как новый элемент генотипа. Такая закрепившаяся мутация может исчезнуть только в результате обратной мутации. Про­явление мутации в фенотипе связано с рядом последовательных процес­сов, которые требуют определенного времени или нескольких кле­точных делений. Новый фенотип проявится лишь тогда, когда измененный ген начнет функционировать. Этапы, необходимые для ре­ализации нового фенотипа, различны для разных клеток и разных типов мутаций.

Запаздывающее проявление мутаций. Если в гаплоидной клетке про­изойдет реверсия, превращающая ауксотрофную мутантную клетку в прототрофную, то такая обратная мутация сразу проявится в феноти­пе. Восстановление способности вырабатывать определенный фермент можно в надлежащих условиях тотчас же распознать. Иначе обстоит де­ло с мутациями, приводящими, наоборот, к ауксотрофному состоянию, например к утрате способности синтезировать определенную аминокис­лоту. Такие мутации удается распознать лишь по прошествии периода, включающего несколько клеточных генераций. Запаздывающее проявле­ние объясняется в данном случае тем, что, хотя мутация и делает невоз­можным синтез необходимого фермента, еще продолжает какое-то вре­мя действовать фермент, синтезированный ранее. Новый признак проявится лишь тогда, когда в результате клеточных делений произой­дет достаточное «разбавление» этого фермента. С запаздывающим из­менением фенотипа приходится также считаться при выявлении фаго-устойчивых бактерий. Если фагочувствительные бактерии приобретают устойчивость в результате мутации, ведущей к утрате способности син­тезировать особое рецепторное вещество, то эта устойчивость выявится лишь тогда, когда в результате ряда клеточных делений это вещество будет в достаточной мере разбавлено.

У многоядерных (ценоцитных) клеток тоже следует различать мута­ции, приводящие к приобретению и к утрате какой-либо функции. Мно­гие бактерии имеют по нескольку ядер (хромосом). Клетки Escherichia coli при быстром росте на средах, богатых питательными веществами, содержат в среднем по четыре хромосомы. При мутации с приобрете­нием функции доминирует мутантная хромосома: она сразу же вызы­вает синтез нового фермента, и мутация немедленно проявляется в фе­нотипе. Если же в многоядерной клетке произошла мутация с утратой функции, она оказывается рецессивной. При многократном делении кле­ток ядра распределяются по разным дочерним клеткам (сегрегация ядер, рис. 15.7). Дефект может проявиться лишь в той клетке, у которой все

ядра содержат мутировавший ген. Потомство такой клетки предста­вляет собой генетически чистый клон. Таким образом, при мутациях с утратой функции в случае многоядерных клеток следует учитывать как сегрегацию ядер, так и проявление мутации в фенотипе.