Перенос генетического материала путем прямого контакта между дву­мя клетками называется конъюгацией. Уже давно на основании морфо­логических данных предполагали, что и у бактерий может происходить своего рода спаривание; однако только эксперименты с множественны­ми мутантами бесспорно доказали, что и у бактерий возможна передача генетического материала при прямом межклеточном контакте. В 1946 г. Ледерберг и Татум провели решающий опыт с двумя мутантами Е. coli К12, каждый из которых был ауксотрофным по двум различным ами­нокислотам (рис. 15.14). Один двойной мутант нуждался в аминокисло­тах А и В, но был способен синтезировать С и D (А ~ В ~ С * D⁺); другой мутант был ему комплементарен (А ^т В ^т С~ D"). Эти мутанты не росли на минимальной питательной среде и не обра­зовывали колоний. Однако если на ту же минимальную среду высевали смесь суспензий обоих мутантов, то колонии появлялись. Клетки этих колоний обладали наследственной способностью синтезировать все аминокислоты, т.е. принадлежали к типу A ⁺ B ⁺ C ⁺ D⁺ (были прото-трофными). Такие клетки возникали с частотой 1 :10^б; это были генети­ческие рекомбинанты - они объединяли в себе генетическую информацию двух реципрокно дефектных (взаимодополняющих) родительских кле­ток. Использование в качестве исходных штаммов множественных му­тантов исключало возможность появления ревертантов, так как вероят­ность одновременной реверсии по двум генам составляет величину по­рядка 10~¹⁴-10~¹⁶ на генерацию. Необходимой предпосылкой реком­бинации служил прямой контакт родительских клеток.

Направленный перенос генов из клетки в клетку. Эксперименты по

15.14

скрещиванию, в которых один из родительских штаммов был стрепто­мициноустоичивым, позволили сделать вывод, что генетический мате­риал передается лишь в одном направлении. Если клетки после скрещи­вания высевали на среду, содержавшую стрептомицин, то рекомби­нанты возникали только в тех случаях, когда один из штаммов (штамм-реципиент) был стрептомициноустоичивым и выживал. Как вел себя другой родительский штамм, было несущественно; он мог быть стрептомициночувствительным и мог на этой среде погибнуть-доста­точно того, чтобы он успел выполнить свою функцию донора генетиче­ского материала. Отсюда можно было заключить, что перенос генети­ческого материала происходит в одном направлении - от донора («мужского» штамма) к реципиенту («женскому» штамму)-и что весь процесс рекомбинации и расщепления протекает в клетках штамма-ре­ципиента. Рекомбинанты наследуют большинство своих признаков от реципиента, а от донора получают только фрагменты генома.

Фактор F и состояние Hfr. При исследовании процесса скрещивания бактерий выяснилось, что способность клетки быть донором связана с наличием особого фактора, который при конъюгации передается из одной клетки в другую - полового фактора F (от fertility - плодовитость). Клетки, не содержащие фактора F (клетки F~), могут функционировать только как реципиенты. При конъюгации, т.е. при прямом контакте между клетками, частота передачи фактора F близка к 100%. Таким образом, клетки-реципиенты в результате конъюгации превращаются в потенциальных доноров; при этом хромосомные признаки еще не передаются.

Фактор F представляет собой кольцевую двухцепочечную молекулу ДНК с массой 45 10⁶ Да. В качестве внехромосомного автономно ре-плицируемого элемента ДНК ее следует отнести к плазмидам. Эта мо­лекула содержит гены, ответственные за процесс конъюгации, в том числе гены, детерминирующие особые структуры клеточной поверхно­сти, например половые волоски, или F-пили (рис. 15.15), необходимые для конъюгации. По всей вероятности, они служат для взаимного узна­вания при контакте между клеткой-донором и клеткой-реципиентом и делают возможным образование конъюгационного мостика, по кото­рому ДНК переходит внутрь клетки-реципиента. Пока не ясно, происхо­дит ли такая «инъекция» ДНК через сами F-пили.

В популяции F⁺ лишь немногие клетки способны быть донорами хромосомной ДНК. Оказалось, что это те клетки, в которых фактор F интегрировался в бактериальную хромосому (рис. 15.16). Если клоны таких клеток-доноров использовать в экспериментах со скрещиванием, то рекомбинанты образуются примерно в тысячу раз чаще, чем при ис-

пользовании обычных клеток F ⁺. Клетки-доноры, обеспечивающие вы­сокую частоту рекомбинаций, получили название клеток Hfr (от англ. high frequency of recombinants). Фактор F включается в бактериальную хромосому лишь в определенных участках, число которых ограниченно; этот процесс сравним с интеграцией фага X (лямбда) в хромосому клет­ки-хозяина (см. рис. 4.14, 15.12 и 15.16).

Процесс переноса. Если смешать популяцию клеток Hfr с избытком клеток F ~, то почти каждая клетка Hfr найдет себе партнера F ~ и бу­дет с ним конъюгировать. Из такой смеси через определенные проме­жутки времени брали пробы и, сильно встряхивая их в смесителе, на­сильственно разъединяли партнеров. Затем пробы переносили на чашки с агаром для выделения рекомбинантов. И наконец, исследовали ре-комбинантные штаммы, чтобы выяснить, какие гены были переданы до­норами клеткам-реципиентам. Исследования показали, что каждый ген передается в совершенно определенный момент времени после начала конъюгации (рис. 15.16). Временная последовательность переноса генов соответствовала порядку их расположения в бактериальной хромосоме, установленному в результате генетического анализа. Это значит, что любой  штамм Hfr представляет собой   гомогенную  популяцию,   все клетки которой передают свою хромосому реципиенту одинаковым образом-начиная с определенного участка (начала) и в одном и том же направлении. Чем дальше располагается тот или иной ген от «начала» хромосомы, тем позже он передается и тем реже попадает внутрь клет­ки-реципиента, даже если конъюгацию не прерывать искусственно, Перенос всей хромосомы Е. coli продолжается при 37°С около 100 мин. Эксперименты, осуществленные по принципу «прерванной конъюгации», сделали возможным составление генетических карт.

Разные штаммы Hfr, выделенные независимо друг от друга из одно­го и того же штамма F ⁺ , различаются по двум главным признакам: роль «начала» играет у каждого штамма иная точка хромосомы и каждый штамм отличается своей специфической последовательностью переноса генов. Результаты экспериментов согласуются с представле­нием о том, что фактор F при интеграции (т. е. при переходе в состоя­ние Hfr) может включаться в бактериальную хромосому в одном из примерно 20 возможных генных локусов. При переносе бактериальная ДНК реплицируется, начиная от места включения фактора F, и вновь синтезированная цепь, двигаясь 5'-концом вперед, проталкивается внутрь клетки-реципиента. Вслед за этим процессом переноса в клетке-реципиенте происходит гомологичная рекомбинация между донорской ДНК и собственной ДНК реципиента. Взаимоотношения между клет­кой F~, клеткой F⁺ и клетками Hfr представлены на рис. 15.16.

Генетическая карта. В результате применения описанного выше ме­тода прерванной конъюгации, позволяющего выяснить временную по­следовательность переноса генов из клетки-донора, можно составить карту расположения генов в бактериальной хромосоме (рис. 15.17). Ско­рость их переноса в течение всего процесса остается постоянной. Мо­менты перехода внутрь клетки-реципиента позволяют судить о расстоя­ниях между ними в хромосоме. При использовании этого метода не удается учитывать различия менее одной минуты. Для более тонкого картирования может служить анализ сцепления при трансдукции (пере­носе генов фагом).

Для Escherichia coli K12 известно расположение более чем тысячи ге­нов, главным образом структурных, кодирующих ферменты. Последо­вательность расположения генов на бактериальной хромосоме была определена для Salmonella typhimurium, Streptomyces coelicolor, Bacillus subtilis и некоторых других бактерий.

Перенос генов при посредстве фактора F'. Интеграция (включение) фактора F в бактериальную хромосому обратима. F-фактор может быть высвобожден из хромосомы, и тогда клетка Hfr становится клет­кой F⁺ (рис. 15.16). Этот процесс «вырезания» (эксцизии, выключения) происходит примерно с той же частотой, что и интеграция. При пра­вильной эксцизии разрыв происходит в том же самом месте, что и при интеграции. В редких случаях он происходит где-то очень близко к это­му месту, и в результате соседний участок ДНК остается присоеди­ненным к фактору F. Этот фактор F, содержащий небольшой фрагмент

хромосомной ДНК, называют фактором F'. Возникновение фактора F' аналогично образованию фага, осуществляющего специфическую транс-дукцию (разд. 15.3.3).

Клетку, содержащую фактор F', называют первичной клеткой F'. Включившаяся в F-фактор ДНК теперь может передаваться клетками-донорами F' штаммам F~   с такой же высокой частотой (100%), что и при обычной передаче фактора F штаммами F⁺ реципиентам F ~. Тот же самый фрагмент ДНК мог бы передаваться штаммом Я/г штамму F ~ с максимальной частотой 1%. Если фактор F' будет перене­сен из первичной родительской клетки F' (где он впервые возник) в нор­мальную клетку F ~, то образуется вторичная клетка F', в которой не­большой участок бактериальной хромосомы окажется удвоенным (будет в диплоидном состоянии).

Распространенность конъюгации среди других групп бактерий. Переда­ча генов путем конъюгации, открытая у Escherichia coli, очень широко распространена у энтеробактерий.

Посредством переноса факторов F из Е. coli K12 в клетки Salmonella и Shigella удалось создать новые генетические системы. Сходные си­стемы были найдены в группе псевдомонад. Конъюгация у энтеробакте­рий представляет собой высокоразвитый процесс; чтобы она осуществи­лась, достаточно суспендировать смесь клеток-партнеров в жидкой среде и оставить на некоторое время в покое. У многих других бакте­рий конъюгацию удается вызвать лишь в том случае, если колонии обо­их партнеров будут хорошо перемешаны и размазаны на твердой среде, где они должны затем расти несколько дней. Если теперь распределить клетки по одной на селективной среде, то окажется, что у многих кле­ток возникла новая комбинация признаков и, по всей вероятности, про­изошел обмен крупными участками бактериальных хромосом. Про­цессы конъюгации широко изучались на Streptomyces coelicolor, видах Nocardia, Rhizobium и других бактериях. Обмен генами путем конъюга­ции и мобилизация генов с помощью плазмид, вероятно, очень распро­странены в мире прокариот.

Плазмиды

Многие (если не все) бактерии могут содержать внехромосомные эле­менты ДНК. Эти малые по сравнению с бактериальной хромосомой, замкнутые в кольцо двухцепочечные ДНК называют плазмидами. При росте в обычных условиях бактерии могут без них обходиться: клетки, «излеченные» от плазмид с помощью УФ-облучения, митомицина С или акридинового красителя, хорошо растут на обычных пита­тельных средах. Плазмиды распознаются по особым свойствам, ко­торые приобретает содержащая их клетка. Некоторые плазмиды де­лают клетку способной конъюгировать с другими клетками. Это обеспечивает дальнейшее распространение таких плазмид путем прямо­го межклеточного контакта. С прототипом подобного рода плазмиды мы уже встречались (с. 457) при рассмотрении F-факторов Escherichia coli.

Факторы фертильности (F-факторы). Это, как уже говорилось, плаз­миды, которые могут включаться в бактериальную хромосому подобно ДНК умеренного фага лямбда. Они «мобилизуют» генетическую ин­формацию этой хромосомы и осуществляют перенос ее в другую клет­ку. Такой перенос (конъюгация) был хорошо изучен на Е. coli.

Факторы резистентности (R-факторы). Бактерии, устойчивые (рези­стентные) к некоторым антибиотикам, были впервые открыты в 50-е годы в Японии. Речь идет о штаммах возбудителя дизентерии Shigella, выделенных от больных, которых лечили антибиотиками. Характерно то, что бактерии обнаруживали множественную устойчивость и что эта устойчивость могла передаваться другим бактериям, таким как Escherichia coli. Как стало теперь известно, факторы резистентности (R) содержат гены, которые делают клетку устойчивой, например, к сульфонамидам, стрептомицину, хлорамфениколу и тетрациклину. Не­которые К-факторы обусловливают резистентность сразу к восьми ан­тибиотикам, другие же придают устойчивость к ядовитым тяжелым ме­таллам, например ртути, никелю, кадмию или кобальту. К-плазмида несет две группы генов: 1) гены, ответственные за передачу плазмиды путем конъюгации (гены tra),-они образуют так называемый «фактор переноса устойчивости» (RTF, resistence transfer factor); 2) гены, обусло­вливающие собственно резистентность (они составляют лишь неболь­шую часть плазмиды) (рис. 15.18).

Фактор переноса устойчивости (RTF) включает все гены, ответ­ственные за перенос фактора R из клетки в клетку, который осущест­вляется обычно путем конъюгации. Таким образом, фактор R, так же как и фактор F, в широком смысле инфекционен. Область RTF по своей молекулярной структуре гомологична соответствующей области F-фак-тора Е. coli. Для некоторых К-факторов характерен широкий круг хо­зяев; возможен их перенос между несколькими разными родами бакте­рий, что способствует их дальнейшему распространению. В некоторых случаях наблюдали, что вместе с фактором R передаются и хромо­сомные гены, которые, по-видимому, были мобилизованы им.

Механизм устойчивости к антибиотикам, определяемой К-факторами, может быть не таким, как в случае ее хромосомного наследования. На­глядным примером этого служит резистентность к стрептомицину. Если она зависит от хромосомного гена, то она связана с изменением субъ­единицы 30S рибосомы, так что бактерия не имеет мишени для воздей­ствия стрептомицина (разд. 2.2.2). В отличие от этого устойчивость, обусловленная К-фактором, основана на инактивации антибиотика в ре­зультате его аденилирования под влиянием фермента. Ферментативная химическая модификация антибиотиков часто бывает причиной устой­чивости к ним, обусловленной плазмидами; например, хлорамфеникол ацетилируется, канамицин и неомицин подвергаются фосфорилирова-

нию и ацетилированию, а пенициллин инактивируется пенициллиназой. Поскольку и при наличии К-факторов возможна генетическая рекомби­нация, может возникнуть новое сочетание генов, придающее дополни­тельные свойства устойчивости. К-факторы имеют большое значение для химиотерапии; их существование-лишний довод против бескон­трольного применения антибиотиков, так как они могут распростра­няться в популяциях бактерий подобно инфекционным агентам.

Бактериоцины. Многие бактерии синтезируют белки, убивающие родственные виды или штаммы или тормозящие их рост. Эти белки с весьма специфическим действием, бактериоцины, кодируются особыми плазмидами, бактериоциногенными факторами. Бактериоцины были вы­делены из Escherichia coli (колицины), Pseudomonas aeruginosa (пиоцины), Bacillus megaterium (мегацины) и других бактерий.

Другие признаки, определяемые плазмидами. Плазмиды могут содер­жать также гены, обусловливающие ряд специфических биологических свойств, которые в определенных условиях создают селективное пре­имущество. Гены ферментов, необходимых для расщепления камфоры, салициловой кислоты, нафталина, октана, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и многих других необычных субстратов, могут находиться в плазмидах. Мы уже упоминали о плазмиде бактерии Agrobacterium tumefaciens, вызывающей опухоли у растений, и ее биохимической актив­ности (разд. 4.3). Перечень свойств, наследуемых с плазмидами, стал сейчас очень длинным и включает, в частности, азотфиксацию, образо­вание клубеньков, синтез индолилуксусной кислоты, диацетила, гидроге-назы, поглощение Сахаров. Некоторые из этих свойств могут опреде­ляться генами бактериальной хромосомы; это свидетельствует о том, что более или менее часто происходит обмен генами или группами ге­нов между хромосомой и плазмидой. Плазмиды, вероятно, играли очень важную роль в эволюции прокариот.

Несовместимость. Многие бактерии содержат плазмиды различной величины. Сосуществование разных плазмид в одной бактериальной клетке говорит о том, что такие плазмиды совместимы между собой. Однако две родственные плазмиды не могут сосуществовать в одной клетке-они несовместимы. Все плазмиды подразделяются на группы несовместимости: плазмиды, относящиеся к одной и той же группе, не­совместимы друг с другом.